mRNA體外剪接實驗（Minigene檢測技術）

Minigene技術作為體內剪接實驗驗證的替代技術，為體內檢測無樣本，樣本難以獲得或者由于基因表達量等原因無法檢出提供了非常好的選擇，通過人為設計的Minigene重組質粒轉染目的細胞，經RT-PCR產物測序可以直觀有效的驗證mRNA的剪接形式。

但是minigene技術作為替代技術方案，由于質粒mRNA轉錄條件的改變也存在自身技術弊端，傳統的minigene技術常使用類似于pcDNA3.1或pEGFP載體作為驗證載體，在一些野生型質?；蛑谐３１憩F出剪接產物條帶雜亂，剪接失真等不穩定情況，導致結果雜亂不可信，海創科業針對此問題設計出專門應用于minigene技術，可有效改善剪接不穩定的質粒載體pMini-CopGFP，為minigene檢測技術提供更加可靠更加真實的檢測結果。

技術路線

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服務報價

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服務周期

客戶提供

1.   gDNA或者血液樣本。

2.   gDNA要求濃度大于30ng/ul，體積大于20ul。

3.   血液樣本要求提供1ml以上。

4.   無標本提供則采取脫離樣本的技術方案，周期適當增加1-2周，價格不變。

交付結果

1.   構建好的minigene質粒（WT和MT）各一份。

2.   Minigene質粒測序結果。

3.   Minigene  RT-PCR測序結果。

4.   Minigene實驗報告（包括實驗方法，電泳圖，分析結果等）。

pMini-CopGFP圖譜

pMini-CopGFP優點：

1. 獨立的熒光蛋白可有效檢測轉染效率,不受插入基因影響。

2. 專為Minigene實驗設計載體，人源化啟動子結果更加真實可靠。

3. 獨立添加外源內含子，穩定基因表達。

4. 通用化RT-PCR引物設計有效排除內源性基因表達干擾。

實驗數據對比

本實驗通過pEGFP載體和pMini-CopGFP載體插入人源CSNK2B基因（E4-E6），HEK293細胞CSNK2B基因（E4-E6）做三方對比；pEGFP載體和pMini-CopGFP載體插入人源CSNK2B基因（E6-E7），HEK293細胞CSNK2B基因（E6-E7）做三方對比，本數據結果均在相同的實驗條件下得出，以更接近細胞內源性mRNA擴增產物為依據判斷pEGFP載體與pMini-CopGFP載體的minigene技術剪接效果。

Lane 1: pEGFP-CSNK2B（exonA+exon4+exon5+exon6+exonB）

Lane 2: pMini-CSNK2B（exonA+exon4+exon5+exon6+exonB）

Lane 3: HEK293-CSNK2B（exon4+exon5+exon6）

Lane 4: pEGFP-CSNK2B（exonA+exon6+exon7+exonB）

Lane 5: pMini-CSNK2B（exonA+exon6+exon7+exonB）

Lane 6: HEK293-CSNK2B（exon6+exon7）

Lane M: DNA Marker

將各樣品擴增產物最亮條帶切膠Sanger測序，得出結論：

結論1：CSNK2B基因（exon4-exon6區域）pMini-CopGFP載體剪接產物與HEK293細胞一致，pEGFP載體發生內含子部分序列滯留，pMini-CopGFP載體雖然也有其他條帶出現，但對比傳統pEGFP載體效果優異，結果真實，pEGFP載體則完全未出現預期產物條帶。

結論2：CSNK2B基因（exon4-exon6區域）pMini-CopGFP載體剪接產物，pEGFP載體剪接產物均與HEK293細胞一致，但電泳圖pEGFP載體仍然有其他條帶出現，pMini-CopGFP載體效果更加優異。